チルゼパチド製造：配列構築、脂質化、不純物管理

チルゼパチド（tirzepatide）は39残基の合成ペプチドである。C末端はアミドであり、2つあるリジンのうち一方に、炭素数20の脂肪族ジカルボン酸で終わる分岐した合成側鎖が結合している。欧州の審査記録は、その構造を正確に記している。すなわち、GIPの配列を基礎とし、2位と13位にアミノイソ酪酸を含み、C末端はアミドであり、20位リジン（Lys20）のε-アミノ基が、γ-グルタミン酸と2つの8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸単位から構成されるリンカーを介して1,20-エイコサン二酸に結合している（EMA (CHMP), Assessment Report: Mounjaro, EMA/791310/2022, 21 July 2022, p. 13）。創製時の論文も同一の構造を示しており（T. Coskun et al., Molecular Metabolism 2018, 18, 3–14）、承認済みの米国添付文書も同様である（FDA, MOUNJARO (tirzepatide) injection — prescribing information, §11）。

最初に一つ、境界を引いておく必要がある。論文および特許が開示しているのは開発段階の製造経路と工程の考え方であり、それらが必ずしも現在のイーライリリー社の商業生産工程を記述しているとは限らない。本件ではこの点がとりわけ重要である。公開情報には性質の異なる三つのものが存在する。査読済みのキログラムスケールのハイブリッド経路、直線的経路と収束的経路の双方を開示する特許ファミリー、そして2022年に承認申請資料に記載された工程についての規制当局による記述である。これらは同一の化学を記述しているわけではない。

本稿の主張を一文で述べる。チルゼパチドの製造が難しいのは、個々の反応に前例がないからではない（前例のない反応は一つもない）。長く、化学的に不均一な一本のペプチド上で、配列の忠実性、立体化学的な完全性、位置選択的な脂質化、そして精製の選択性が、すべて同時に成立していなければならないからである。このうちどれか一つに小さな失敗が生じるだけで、鎖長が正しく、質量もほぼ同じで、しかも除去しにくい最終製品の不純物が生じうる。

チルゼパチドはペプチドであり、かつ位置選択的なコンジュゲートでもある

製造対象は、一本の配列に加えて、決まった位置に、決まった側鎖が、決まった様式で結合したものである。そしてこの後半部分は、それ自体の供給網、不純物プロファイル、分析上の負担を伴う。EPARに記載された体系的化学名は、その結合順序を正確に確定している。Lys20のε-窒素から外向きに読むと、リンカーは AEEA → AEEA → γ-グルタミン酸 → C20ジカルボン酸の順で並ぶ。グルタミン酸はγ-カルボキシル基で結合し、α-アミノ基はジカルボン酸によりアシル化され、α-カルボキシル基は遊離のまま残る。先行する化合物特許は、同じ結合関係を2つの [2-(2-amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl 単位、1つの γGlu、および CO–(CH₂)₁₈–CO₂H として記載している（US9474780B2, GIP and GLP-1 co-agonist compounds, Eli Lilly and Company, priority 9 January 2015, granted 25 October 2016）。2つの文書が順序について一致していることには意味がある。順序を誤って組み立てたリンカーは、質量が極めて近いにもかかわらず別の分子になるからである。

同じ化学名を読み込むと、製造上の問題を形づくりながら、要約では通常省かれる事実がいくつか得られる。この配列にはリジンが2つ含まれる。Lys20が側鎖を担い、Lys16は規定された構造において修飾されていない。システインもメチオニンも含まれない。この事実は不純物の空間を二つの具体的な意味で限定する。形成および管理を要するジスルフィド結合が存在しないこと、そしてメチオニンの酸化がこの配列の経路ではないことである。ただし、そこから酸化のリスクが存在しないという結論は出ない。Trp25と2つのチロシンは、依然として酸化およびアルキル化に感受性のある部位である。4残基はグリシン、2残基はAibであり、いずれも不斉をもたない。EPARは、天然アミノ酸がL体であること、GlyおよびAibには不斉中心がないことを記載している。

構造上の特徴	製造上の帰結	管理上の意味	エビデンスの水準
39残基、C末端アミド	約38回のカップリングと同程度の回数の脱保護。そのそれぞれが欠陥の生じる機会となる	逐次的な反応完結度は、前提とせず監視する	公的資料による。工程数は算術的な見積り
2位および13位のAib	立体障害のあるアシル化剤であり、導入後はその α-アミノ基が立体障害のある求核剤となる	当該部位とその近傍では製品固有の条件が必要	位置は公的資料による。開示された2つの経路はいずれも Ile12→Aib13 を個別に扱っている
AibとGlyには不斉中心がない	6か所はエピマー化しえない。対象となるのは残る33個の不斉α-炭素と、側鎖の γGlu 不斉中心である	立体化学の管理は部位ごとに考える	不斉の不在はEPARの記載。個数は当該化学名からの導出
リジンが2つあり、Lys20が規定された部位	選択的アシル化は設計して作り込む必要があり、だからこそ直交保護が用いられる	Lys20に直交保護を施し、Lys16は最終切断まで保護したままとする	2つのリジンはいずれもEPARの化学名に現れる。直交性が失われた場合、Lys16がアシル化された化学種は構造的には起こりうるが、本稿で確認した資料において報告された不純物ではない
Lys20上の分岐側鎖	第二の合成と供給網が一つの分子に合流する	それ自体の規格と変更管理が必要	組成は公的資料による。コンジュゲーションに関する要求はEMAガイドラインにある

表1. チルゼパチドの構造上の特徴、それぞれが製造上に課す負担、および各関連づけに対する公開エビデンスの強さ。

39残基の配列は累積的な構築の問題を生む

逐次合成には、収束的経路にはない性質がある。すべてのサイクルが掛け算になるという性質である。収率の予測として扱わないという前提のもとで、規模感をつかむには次の理想化した式が使える。

理想化した全長体の割合 ≈（1工程あたりの成功率）^（構築事象の回数）

直線的な39残基ペプチドでは、主鎖のカップリングは約38回である。1工程あたりを理想的に99.5%とすると 0.995³⁸ ≈ 83%、99.0%とすると 0.990³⁸ ≈ 68% となる。脱保護も独立した機会として数えると指数はほぼ倍になり、0.995⁷⁶ ≈ 68%、0.990⁷⁶ ≈ 47% となる。逆向きに計算すると要求水準がはっきりする。38回のカップリングを通じて鎖の90%を保つには、1工程あたり約99.72%が必要である。

これらの数値は例示であり、しかも複数の方向に誤っている。各工程は独立ではない——凝集は、一度うまくいかなかったカップリングの次が再びうまくいかない確率を高める——また効率も一様ではない。開示された経路が特定の部位で異なる条件を用いているのは、まさにそこでは平均値が成り立たないからである。さらにこの式は鎖の構築のみを対象としており、切断、側鎖の導入、析出、クロマトグラフィー、単離における損失については何も述べていない。

公開されたキログラムスケールの数値が補正として役に立つ。先行する製造方法特許では、Sieberアミド樹脂を用いた直線的SPPSの実施例について、HPLC純度97.7%超、ペプチド含量88.4%のチルゼパチドを14.5 kg単離し、**樹脂担持量基準の総収率は46%**と報告されている（WO2020159949A1, Process for preparing a GIP/GLP1 dual agonist, Eli Lilly and Company, priority 29 January 2019, published 6 August 2020, Example 4B）。同じ実施例は、精製前の段階のほうがより多くを語る。Preparation 24について32 kgスケールと記載された2バッチについて、当該特許は粗生成物を24.4 kgおよび21.3 kg、HPLC純度をそれぞれ69.5%および88.3%と報告している。これらは当該開示実施例について出願人が示した数値であり、この分子の一般的性質ではない。70〜90%の範囲にある粗生成物と、97%を超えて出荷される原薬との隔たりが、精製工程群が担うべき作業量にあたる。

ペプチド化学の文献はこの点を端的に述べている。固相合成は逐次的な工程であり、誤差が合成全体を通じて累積するため、生物学的発現が備える鋳型依存の忠実性には及ばない（R. Behrendt, P. White, J. Offer, Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis, J. Pept. Sci. 2016, 22, 4–27）。この隔たりがあるために、治療用ペプチドの開発とペプチドの工程開発は切り離せない。探索段階で下された配列の決定が、構築の負担を恒久的に確定してしまうからである。

長鎖SPPSがスケールアップで難しくなる理由

長鎖の固相合成における困難は、ミリグラムスケールの困難を拡大したものではない。鎖が長くなったときにのみ現れるものがあり、反応器が大きくなったときにのみ現れるものもある。樹脂上での凝集は一般的であり、しばしば重要な困難でもあるが、本稿で確認した資料は、それがチルゼパチドの製造において支配的な失敗様式であることを立証していない。鎖が伸びるにつれ、樹脂に結合したペプチド間の水素結合によって溶媒化された状態が崩れ、伸長中のN末端は接近しにくくなる。先述のFmocに関する総説はこれを、樹脂上でペプチドの溶解性が再び低下する現象として位置づけ、ペプチド合成における主要な障害はペプチドの凝集であると結論している。これは難合成配列の文献で詳しく展開されている主題でもある（M. Paradís-Bas, J. Tulla-Puche, F. Albericio, The road to the synthesis of "difficult peptides", Chem. Soc. Rev. 2016, 45, 631–654）。凝集は独立した不純物生成機構ではなく、他の機構にかかる乗数である。接近できないアミノ基はカップリングの不完全さをもたらし欠失を生む。遮蔽されたFmoc基は脱保護の不完全さをもたらし、別の位置に異なる欠失を生む。

標準的な緩和策は手順上のものではなく構造上のものである。主鎖アミドの保護と擬プロリンジペプチドは、いずれも水素結合した二次構造を崩すことで機能し、難合成配列について比較もなされている（S. C. F. Sampson, W. Patsiouras, N. J. Ede, J. Pept. Sci. 1999, 5, 403–409）。本件では仮定の話ではない。当該製造方法特許のN末端フラグメントは、4位と5位にあたる Gly-Thr 擬プロリンジペプチドを用いて構築されている。

スケールは、配列とは無関係の制約も加える。固相合成が消費する溶媒と試薬の量は、製品質量ではなく樹脂体積に比例する。より環境負荷の小さいペプチド原薬製造工程が、重要な未充足ニーズとして挙げられた理由はここにある（A. Isidro-Llobet et al., J. Org. Chem. 2019, 84, 4615–4628）。また、膨潤した高分子内部への物質移動は、撹拌を強めても改善しない。そのため実験室で検証されたカップリングが製造用反応器では異なる挙動を示しうる。これは低分子原薬のスケールアップを支配する技術移転の問題と同じものである。

一つの構造的な違いが管理の考え方を変える。通常の合成では、ある工程の失敗は次の単離で捕捉される。直線的SPPSでは切断まで単離がないため、構築の過程で得られる情報は、工程内管理が樹脂上で見ているものに限られる。だからこそ開示された実施例は、紫外吸収で確認したFmoc脱離率99%超、側鎖を結合させる前の保護リジン残存率1%未満といった目標値を定めているのである。

非天然残基は化学と原材料管理の両方を変える

Aib——2-アミノイソ酪酸、別名2-メチルアラニン——は、α-炭素上にメチル基がもう一つ付いたアラニンである。この置換は同時に二つのことを行う。

化学的には、α,α-二置換によってこの残基は両側で立体障害を受ける。Fmoc-Aib-OH は立体障害のあるアシル化剤であり、導入後はその α-アミノ基が、次の残基がアシル化しなければならない立体障害のある求核剤となる。いずれもチルゼパチドそのものを記述し、いずれも同じ残基番号を用いている2件の独立した先行開示が、一つの接合部を近隣の部位とは異なる扱いにしている。化合物特許の実験室実施例は、12位の Fmoc-Ile-OH を PyBOP と DIEA により25 °Cで24時間カップリングしている。既定条件が90分であることと対照的であり、これは Aib13 へのカップリングである。製造方法特許のキログラムスケール直線的実施例には、工程全体をNMPからDMFへ切り替えた際、Ile12 から Aib13 へのカップリングだけがNMPを維持した唯一の工程であったと記載されている。2件の開示がこの接合部を強化した条件で扱っていることは、当該部位が追加的な工程上の注意を受けたことを示す製品固有のエビデンスである。通常条件下でこの結合が形成できないことの証拠ではなく、チルゼパチドへのあらゆる経路がこの扱いを必要とすることの証拠でもない。

同じ特許は、その実施例において他にどこで手当てが必要だったかも挙げており、粗ペプチドの品質を改善するには "Extended couplings (4h each) for Pro31, Trp25, Gln24, Val23, Phe22, Lys20, Gly4, Glu3 and Aib2" が必要であると述べている。39残基のうち9か所で、Phe22〜Pro31 の範囲と Aib2 の近傍に集まっている。これは出願人が自らの操作について述べたものであり、当該文書自身がその実施例は限定を意図しないと明記している。すなわち、その経路においてどの部位が抵抗を示したかを見る窓であって、普遍的な要求事項ではない。

立体化学的には、Aibは「非天然残基」という語から連想されるのとは逆の挙動を示す。α-炭素上に同一のメチル基を2つもつため不斉中心をもたず、エピマー化しえない。EPARもそのように記載している。したがってエピマー化の対象となるのは、天然残基の33個の不斉α-炭素と、側鎖の (22S) 配置をとる γ-グルタミン酸不斉中心である。3つのイソロイシンと2つのトレオニンのβ-不斉中心は、カップリングではなく構成単位によって決まるため、原材料の属性にあたる。

Aibは汎用品でもない。非タンパク質構成性のビルディングブロックは、それぞれの合成経路、供給者、類縁物質プロファイルをもち、そのいずれかの変更は原薬製造工程の変更である。発効済みの欧州ガイドラインは、カップリング時に母化合物と同様に反応しうる出発物質の不純物について、出発物質の規格において管理および限度設定を行い、その工程中での挙動と除去を評価することを求めている（EMA, Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides, EMA/CHMP/CVMP/QWP/367182/2025, adopted 4 December 2025, in effect 1 June 2026）。これはオリゴヌクレオチドの製造における原材料の適格性評価を支配する「反応性を第一に考える」論理と同じであり、その移転が成り立つ理由は一つである。いずれのプラットフォームも、ビルディングブロックの繰り返し付加によって製品を構築するため、取り込まれうるビルディングブロック由来の不純物は、工程由来ではなく製品由来の不純物になる。両プラットフォームはそれ以外の点では同等ではない。化学、結合様式、分析上の課題はいずれも異なる。

出発物質の選定は ICH Q11 に従う。同ガイドラインの固相担体に関する条項は、ペプチドを樹脂上で構築する場合について "there is a more limited relationship between risk and number of steps from the end of the manufacturing process" と述べている（ICH, Q11, Step 4, 1 May 2012）。したがって本件では、早い段階のビルディングブロックの欠陥が自動的に低リスクとはならない。通常の純度試験では見えないため、名前を挙げておくべきビルディングブロックの属性が2つある。Fmoc-アミノ酸に持ち込まれた酢酸は伸長中の鎖を恒久的にキャップし、しかもRP-HPLCでは検出されない。清浄な構築のためには0.02%未満が求められる。またこの誘導体中の遊離アミノ酸は、ある残基が二重に取り込まれる原因となり、挿入配列を生じうる。いずれも先述のFmocに関する総説に記載されている。

Lys20 は製造上の要所である

この分子の難しさの多くは、一つの残基に集中している。要求はこうである。Lys20のε-アミノ基をアシル化し、Lys16のε-アミノ基もN末端α-アミノ基もアシル化せず、かつ残りの部分は保護したままに保つ。そのためには、他のすべての保護基が維持される条件下で脱離できる保護基がLys20上に必要になる。これは厳密な意味での直交性であり、単に不安定性が異なるということではない。

公開情報には、同一の先行開発者による2つの直交的な解法が示されている。化合物特許は Fmoc-Lys(Alloc)-OH を用い、触媒量の Pd(PPh₃)₄ とフェニルシランでアリルオキシカルボニル基を脱離させ、その後樹脂上で4工程かけて側鎖を伸長する。製造方法特許は Fmoc-Lys(ivDde)-OH を用い、DMF中8%ヒドラジン水和物により4時間で ivDde を脱離させ——保護形の残存が1%未満となるよう監視し、残留ヒドラジンを除くためDMF洗浄を8回行う——その後、側鎖全体をあらかじめ組み立てた1つのビルディングブロックとしてカップリングする。Lys16はBoc基で保護され、最終の酸分解でのみ脱保護される。

この違いは表面的なものではない。パラジウムを用いる脱保護は金属触媒を導入することになり、欧州ガイドラインは金属触媒を使用する場合に考慮すべき規格項目として元素不純物を挙げている。ヒドラジンを用いる脱保護は、反応性が高く毒性学的にも注意を要する試薬を導入するため、活性エステルを投入する前に除去しておく必要がある。洗浄が名目的な1回ではなく8回である理由はそこにある。

この要所には3つの失敗様式がある。Lys20保護基の脱離不完全、あるいは脱離に成功した後のアシル化不完全は、いずれも側鎖をもたない鎖を残す——欧州ガイドラインは、コンジュゲートしたペプチドの追加的品質特性として遊離の未コンジュゲートペプチドを挙げている——が、両者の管理点は異なる。一方は脱保護の反応速度、他方は試薬の化学量論である。過剰反応は二重にアシル化された物質を生じ、ガイドラインはPEGの文脈でこれをジまたはマルチコンジュゲーションと呼び、一般的なコンジュゲーションのリスクとして扱っている。さらに、直交性が失われた場合——アシル化の前にLys16保護基が早期にまたは部分的に脱離した場合——第二の求核部位が露出することになる。Lys16がアシル化された化学種は、直交性が失われたときに構造的には起こりうる帰結であって、本稿で確認した公開資料において報告された不純物ではない。ガイドラインは一般的な形で、位置選択的でないコンジュゲーション生成物が生じうるため管理すべきであると述べている。

この最後の場合こそ、検出にかかる代償という点で分析上の議論が具体化する。二重にアシル化された鎖は質量が異なるため、インタクト質量分析で捕捉できる。一方、結合位置が誤った化学種は製品と分子式を共有するため、そうはいかない。期待される分子量が観測されたこと自体は、側鎖が意図したリジン上にあることの証明にはならない。 それを示すには、修飾の位置を特定できる方法が必要である。MS/MSを用いたペプチドマッピング、または標準品に対する分離である。EPARは、構造決定に LC-MS、インタクト分子の LC-MS/MS、LC-MS ペプチドマッピング、キラル GC-MS、RP-HPLC および IC、NMR、CD、FT-IR、光散乱、細胞に基づく生物活性試験を用いたことを記載している。単一の質量測定ではなく、直交する一式である。

承認申請資料に記載された工程について、慎重に述べておくべき特徴が一つある。EPARは当該原薬を "a standard solid phase peptide synthesis (SPPS) manufacturing procedure including addition of the linear sidechain at Lys20" により製造し、その後ペプチドを樹脂から切断するとともに側鎖の脱保護を同時に行うものとして記述している。つまり側鎖は、ペプチドがまだ樹脂上にある段階で結合される。したがって、出荷試験に供しうる単離された未コンジュゲートペプチドは存在しない。欧州ガイドラインはまさにこの状況に言及しており、未コンジュゲートペプチドを管理が不可欠な中間体として扱い、中間体を単離しない場合にはその方法を正当化し管理戦略を構築すべきであると述べている。樹脂上でのコンジュゲーションは正当な設計である。それは負担を、工程内管理と最終製品の分析へ移すことを意味する。

脂質側鎖はそれ自体が重要な中間体である

C20ジカルボン酸は試薬として現場に届くのではない。開示された製造経路では、完全に組み立てられ直交保護された状態のビルディングブロックとして届く。当該特許は、樹脂に結合したペプチドを t-butyl-eicosanedioyl-Glu-(O-tert-butyl)-(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid)-(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid)-OH とカップリングしている。これは4成分からなる分子であり、内部の順序が定まっており、不斉中心を1つ、保護基を2つ、そして活性化に用いる遊離カルボキシル基を1つもつ。それ自体が一つの小さな合成であり、当該特許におけるその調製では、クロマトグラフィーおよび結晶化の前の粗生成物が目的物52.3 area%を含むと報告されている。

ペプチドではなくこのビルディングブロックに属する不純物の類型がいくつかある。AEEAが1つまたは3つの類縁体、あるいはグルタミン酸を1つではなく2つもつ構造体は、一定の増分だけ目的物と異なり、カップリングされた後は側鎖が誤った全長ペプチドを与える。先行開発者の特許自身の請求項に2つの γGlu をもつ変異体が含まれており、こうした構造が化学的に到達可能であることを示している。グルタミン酸の不斉中心はビルディングブロックによって固定され、そのまま伝播する。アシル化を担う化学種は系中で生成する活性エステルであり、残留した活性化物質は別の場所をアシル化しうる。また最終の酸分解で tert-butyl エステルの脱離が不完全であれば、正しくコンジュゲートされていながら質量単位で56だけ多いペプチドを与える。これは、構築がどれほど正確であっても防げない製品由来の不純物である。

規制上の取扱いは、このビルディングブロックの規模から想像されるより厳しい。欧州ガイドラインは、活性化された誘導体は出発物質として適切でない場合があり、それ自体が中間体となりうること、コンジュゲーションの化学は工程開発の項で記述すべきこと、"conjugatable versus non-conjugatable impurities" をリスク分析により特定すべきこと、そしてリンカーが複数の供給者から供給される場合には供給者ごとに独立した資料と、とりまとめた規格が求められることを述べている。したがってこの側鎖は、試験成績書の付いた購入試薬ではなく、それ自体の変更管理義務を伴う管理された中間体であり、しかも工程全体のなかで最も帰結の大きい一工程に流れ込む。

SPPS/LPPS ハイブリッド経路が変えるもの

公開報告されたキログラムスケールのハイブリッド経路が存在する。イーライリリー社のインディアナポリスおよびKinsaleの拠点のチームが、4つのフラグメントを固相合成で調製し溶液中で連結するキログラムスケールのGMP工程を報告しており、連続運転、リアルタイムの分析モニタリング、および中間体精製のためのナノ濾過を用いている（M. O. Frederick et al., Org. Process Res. Dev. 2021, 25, 1628–1636）。この論文は有料購読対象であり、本稿が利用できたのは抄録の水準までである。したがって、その単位操作について以下に述べる内容は抄録水準のエビデンスである。同じ組織による後年の論文は "four-fragment convergent hybrid SPPS/LPPS strategy" を記述しており、著者らはチルゼパチドの商業的合成を可能にするためにこの戦略を切り開いたと述べている。これは戦略が開発された理由についての著者らの記述であって、それが現在用いられている工程であるという記述ではない。同論文はさらに、天然化学的ライゲーションと連続した脱硫を用いる2フラグメント経路を加えており、両操作の間に接線流濾過を用い、ライゲーションは "without epimerization" 進行したと報告している（A. Jalan et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2026, 65(6)）。この論文も全文は入手できなかった。

製造方法特許は、その機構を具体的に示している。フラグメントのカップリングは、供給流をミキサーで合流させ、滞留時間を定めた押出し流れ型反応器を通す方式である。カップリングは20 °Cで2時間、続くジエチルアミンによるFmoc脱離は1時間である。各カップリングの間には10〜20ダイアボリュームのナノ濾過を行い、次のフラグメントが入る前にカップリング試薬、塩基、ジベンゾフルベンを除去する。出願人が掲げる目的は "an efficient route having fewer steps" である。

フラグメントをどこで切るかという点で公開情報は薄くなる。ここは厳密であるべきところである。2021年の抄録は、選ばれた4つのフラグメントは純度が最も高く単離しやすいものであったと述べているが、その境界は示していない。全文がない状態では、本稿はその境界を示さない。 他の開示は接合部を挙げているが、それらは別個の開示であり、一つの方式にまとめてはならない。製造方法特許の配列表には、22〜30位および31〜39位に対応する部分、ならびに Gly-Thr 擬プロリンを含む Boc-Tyr1 から Leu14 までのN末端部分が示されている。一方、同じ組織による2025年の論文は、30〜39位と定義されたC末端部分を扱っている（P. Agrawal et al., Org. Process Res. Dev. 2025, 29, 2896–2907）。別の研究グループは疎水性タグを用いる液相経路を発表しており（Z.-J. Pang et al., Org. Lett. 2025, 27, 10442–10446）、先行開発者も、脂質部分はフラグメント組立の前でも後でも結合しうると開示している（EP4017866A1, Eli Lilly and Company, priority 19 August 2019——その実施例が扱うのはインクレチン類縁体一般であり、チルゼパチドではない）。この広がりから得られる結論はフラグメントの地図ではない。フラグメント戦略はリスクを再配分するものであり、異なる接合部を選びうるということ、そして接合部とは「どこで清浄にカップリングできるか」についての設計上の判断であるということである。連続運転にも現在では枠組みがある。欧州ガイドラインはこうした手法を ICH Q13 に導いており、同ガイドラインは2021年の論文が出た後の2022年11月に採択された。

	直線的 SPPS	SPPS/LPPS ハイブリッド（開示内容に基づく）
構築	樹脂に結合した1本の鎖、約38回の逐次カップリング	短い4本の鎖を並行して構築し、溶液中で連結
中間体の単離	担持から切断までの間に単離はない	各フラグメントをカップリング前に単離し、規格適合を確認する
誤差が蓄積する場所	鎖全体にわたる。どの位置の欠陥も最後まで運ばれる	フラグメント内部。そこで不合格とできる
新たに生じるリスク	—	活性化された各フラグメントC末端でのエピマー化、カップリング不完全、試薬の持ち込み
報告された基準値	特許実施例において14.5 kg、純度97.7%超、樹脂担持量基準の収率46%	2021年に報告されたキログラムスケールのGMP製造。工程ごとの数値は入手していない
規制当局が記述した内容	2022年のEMA審査報告書は、欧州で承認申請資料に記載された工程を、標準的なSPPSであり樹脂上でLys20に側鎖を結合させるものとして記述している。それはその審査、その時点のものであり、今日のすべてのバッチや地域で用いられている経路を証明するものではない	本製品のハイブリッド経路についての欧州の審査は、本稿では確認していない。2025年のEMAペプチドガイドラインはハイブリッド手法を許容しうるものとして扱い、工程が並行して稼働する場合には同等性データを求めている

表2. 開示された経路に基づく、直線的構築とハイブリッド構築の対比。数値は引用文献における報告値であり、いずれの手法の一般的性質でもない。

ハイブリッド製造はリスクを再配分するが、除去はしない。フラグメントのカップリングはいずれもC末端残基でペプチドを活性化するため、その不斉中心でエピマー化が起こる古典的な条件をつくる。ライゲーションがエピマー化を伴わずに進行したという主張を明記する価値があるのはそのためであり、天然化学的ライゲーションが魅力的であるのもそのためである。この化学は、接合部のシステインを介して、保護されていないフラグメントを水系で化学選択的に連結する（P. E. Dawson, T. W. Muir, I. Clark-Lewis, S. B. H. Kent, Science 1994, 266, 776–779）。そしてチルゼパチドにはシステインがない。先行する製造方法特許は、この点を自らの言葉で整合させている。同特許は天然化学的ライゲーションを、システインまたはアラニンを含むペプチドに有用な手法として記述し、一過性のチオエステル連結中間体が転位して天然のアミド結合になるとしている。そして同特許自身のチルゼパチドに対するライゲーション実施例では、ペプチドヒドラジドをチオリシスによりチオエステルとし、続いてラジカルによる、遷移金属を用いない脱硫を行っている。したがって、システインをもたない配列について「アラニン部位でライゲーションし、その後脱硫する」ことは文献上裏付けのある化学である。ただし、どのアラニンであるかは、本稿が利用できた資料からは確定できない。

エビデンスの境界は慎重に引く必要がある。これらの文書が述べていることは同一ではない。2021年の論文はハイブリッド経路によるキログラムスケールのGMP製造を報告している。2026年の論文の著者らは、4フラグメント戦略を開発した理由として商業的合成を可能にすることを挙げている。2022年の欧州の承認を支えたCHMPの審査は、承認申請資料に記載された原薬製造工程を、標準的なSPPSであり樹脂上でLys20に側鎖を結合させるものとして記述している。これらは必ずしも矛盾しない——工程は製品のライフサイクルのなかで変わりうるし、審査報告書はその時点で申請資料に記載されていた内容を記述する——が、それぞれ別のことについての別の主張である。そして本稿で確認した公開情報のなかには、現在の商業生産でどの経路が用いられているかを確定できるものはない。複数の原薬製造工程が並行して稼働する場合、欧州ガイドラインは原薬レベルの同等性データを求めている。

そうなると、フラグメントの品質がそのまま最終製品の品質になる。各フラグメントには、確認された同一性、純度、含量、そして明確な末端の状態——どちらの末端にどの保護基があるか、脱落したものがないか——が必要である。欠失を含むフラグメントは、カップリングされた時点で最終製品の「全長マイナス1」になる。活性化されたC末端残基でエピマー化したフラグメントはジアステレオマーになる。カップリングが1%不足したフラグメントは、その1%を最終の不純物プロファイルに持ち込み、以降の工程がそれを優先的に除去することはない。フラグメントのカップリングが不完全であれば、直前のフラグメントが製品と性質の近い短鎖体として残る。また次工程へ持ち込まれた残留活性化種は、誤った求核部位をアシル化しうる。開示された経路が酢酸でクエンチしてからナノ濾過を行う理由はそこにある。1残基だけ異なる同族フラグメントの管理が最も難しい。類縁物質の総量で設定した規格では、無害な不純物と取り込まれうる不純物を区別できないからである。

チルゼパチド製造の不純物マップ

以下の分類は発効済みの欧州ガイドラインに従っている。同ガイドラインは製品由来の不純物を起源別に——出発物質、製造中の生成、製造中または保管中の分解——区分し、試薬、溶媒、元素不純物、ニトロソアミンといった非ペプチド性不純物とは分けて扱っている。各行について2つの注意がある。ここに機構が挙げられていることは、その不純物がチルゼパチドにおいて実質的な水準で生じることのエビデンスではない。これらの機構は一般的なペプチド化学であり、ある機構をこの分子に結びつける資料がある場合には表中に明記している。また、EPARは ICH Q3A の安全性確認閾値を超える不純物について確認が行われたことを記載しているものの、その一覧を公表していない。したがってどの行も、承認申請資料に記載された規格として読むべきではない。

段階	不純物の類型	考えられる機構	製品への帰結	最適な管理点	分析による確認	エビデンスの水準
原材料	取り込まれうるビルディングブロック不純物と、それが引き起こす挿入	誤った鏡像体または立体異性体、LeuにかわるIle、β-Ala誘導体、遊離アミノ酸によるある残基の二重カップリング、酢酸による鎖のキャップ	立体異性体、公称質量が同一のペプチド、残基の重複、キャップされた短鎖体	ビルディングブロックの規格	キラル GC-MS、MS/MS、RP-HPLCでは酢酸を見逃す	EMAガイドラインおよびFmoc総説。チルゼパチドはIleを3つ、Leuを2つもつ
構築	欠失配列およびキャップされた短鎖配列	いずれかのサイクルでのカップリングまたは脱保護の不完全、失敗した鎖のその後のアセチル化	多数の位置のいずれかで残基を欠く鎖、キャップされた鎖はより分離しやすい	カップリングの工程内管理、再カップリング、抵抗のある部位での強化条件	RP-HPLCとMSの併用、位置特定にはペプチドマッピング	一般的機構。2件の先行開示がいずれも Ile12→Aib13 を強化しており、うち1件は自らの実施例で延長カップリングを要する9か所を明示している
構築	エピマー化	活性化されたα-炭素でのオキサゾロン形成	製品のジアステレオマー	ウレタン型保護、添加剤、温度、活性化時間	キラル GC-MS、エピマー標準品に対する LC	一般的機構。EPARはキラル GC-MS の使用を記載
構築	アスパルチミドおよびその開環生成物	塩基による Asp での環状イミド形成、その後の加水分解またはアミンによる攻撃	α/β異性体およびエピマー。いくつかは質量が近接する	Asp保護基の選択、塩基の組成、曝露時間	標準品を用いた RP-HPLC	一般的機構。本品における発生は立証されていない
構築	デプシペプチド異性体	アミド結合ではなくエステル結合。正確な位置は公開文書では立証されていない	製品の異性体。分子式は同一	塩基による製品への転化（pH 8.5〜9.5）であり、除去ではない	クロマトグラフィー、転化挙動	WO2020159949A1 において名称が与えられ、粗生成物の10〜15%と定量され、請求項にも記載されている
フラグメント連結	フラグメント由来の変異体	カップリング不完全、欠陥のあるフラグメントの持ち込み、残留活性化種	大きな短鎖体、または全長のジアステレオマーもしくは欠失体	フラグメントの出荷試験、クエンチとナノ濾過	フラグメント段階の LC-MS、最終品のペプチドマッピング	ハイブリッド経路に限る。水準は公表されていない
脂質化	コンジュゲーションの程度と位置：未コンジュゲートペプチド、多重コンジュゲーション、位置を誤ったアシル化	Lys20の脱保護またはアシル化の不完全、過剰アシル化、Lys16の直交性の喪失	側鎖がない、二重にアシル化された鎖（質量が異なる）、または製品と分子式を共有するLys16アシル化体	脱保護とアシル化の工程内管理、化学量論、保護の完全性	前二者はインタクト質量、位置特定には MS/MS ペプチドマッピング	EMAガイドラインに一般的な記載がある。本稿で確認した資料には、Lys16がアシル化されたチルゼパチド不純物の報告はない
脂質化	リンカー組成の変異体	ビルディングブロックにおける AEEA 数、グルタミン酸数、または順序の誤り	側鎖が変化した全長ペプチド	側鎖中間体の規格	ビルディングブロックの LC-MS、製品の MS/MS	関連する構造が特許請求項にある
切断	側鎖のアルキル化、脱保護不完全	保護基が反応性のカチオンとして遊離、tert-butyl または Boc の残存	TrpまたはTyrの修飾、あるいは一定の質量増分	捕捉剤の組成、切断時間	RP-HPLCとMSの併用、インタクト質量	EMAガイドライン。Trpの緩和策は文献に記載がある（Fields & Fields 1993）
精製／保管	分解生成物および高分子量体	酸化、加水分解、異性化、脱アミド、ジケトピペラジンおよびピログルタミン酸の生成、二量体および多量体、自己会合	多様。加えて目的物より大きい化学種	保持時間、温度、溶媒、濃度、保管条件	安定性指示性試験法、SEC	EMAガイドラインの経路一覧。EPARの規格に SEC があり、EPARは保管条件下で分解が認められなかったことを記載

表3. 製造段階ごとの不純物マップ。太字の項目には製品固有の公開エビデンスがある。それ以外は一般的機構であり、本品における関連性には製品固有の確認が必要である。

デプシペプチドの行は公開情報のなかで最も明確な製品固有の事例であり、当該特許は細かく読む価値があるほど具体的である。開示された直線的実施例では、粗生成物を1:1のアセトニトリル／水に溶解し、アンモニア水でpHを8.5〜9.5に上げて、粗生成物の10〜15%とされるデプシペプチド異性体のチルゼパチドへの転化を開始させ、1時間以上保持する。請求項はこれをpH 7〜10に一般化している。特許が用いている語は転化であり、除去ではない。デプシペプチドは製品と分子式を共有するエステル結合の異性体であり、開示されたこの工程は、それを分離して取り出すのではなく製品へ戻している。同じ溶解保持の工程は、トリプトファンのCO₂塩をチルゼパチドへ転化させる役割も担い、全体で7時間以上を要する。これが支持する範囲には2つの限界がある。特許は異性体を複数形で述べ、それらを配列番号によってのみ定義しているが、その構造は公開文書では機械可読ではない。したがって本稿で確認した公開開示は、同じエステル結合または同じ生成経路がチルゼパチドのあらゆる経路に当てはまることを立証していない。また転化の収率は報告されていないため、定量的な回収を示唆するものは何もない。チルゼパチドには確かにセリンが5つ、トレオニンが2つあり、こうしたエステルはそのいずれかに位置しうる。

なぜ精製は上流のあらゆる誤りを修復できないのか

逆相クロマトグラフィーは疎水性で分離する。失敗生成物がその点で製品と異なる場合にはよく機能し、異なる点がそこでない場合には十分に機能しない。

有利な場合は実在する。数残基を欠いたアセチル化短鎖体や、2本目のC20鎖をもつ化学種は、十分に開発された分取法で分けられる程度に異なる。これは成熟した分野であり、負荷量、選択性、回収率について多くの文献がある（R. S. Hodges, T. W. Lorne Burke, C. T. Mant, J. Chromatogr. A 1988, 444, 349–362）。そのために開発された固定相についても同様である（L. F. Lloyd, M. B. Millichip, C. M. Watkins, J. Chromatogr. A 2002, 944, 169–177）。

不利な場合が管理戦略を規定する。39残基ペプチドで1残基が欠けても疎水性の変化はわずかである。エピマーでは変化はさらに小さい。側鎖の位置異性体やデプシペプチド異性体では、組成がまったく変わらない。アスパルチミドの類型について、先述のFmoc総説は端的である。ピペリジド副生成物は多くの場合RP-HPLCで容易に分離できるが、"resolution of the epimerised α-aspartyl peptide is very difficult or impossible" とされている。これは同総説が自らの文脈について下した評価であり、この限界についての最も鋭い公表された記述である（あわせて R. Subirós-Funosas, A. El-Faham, F. Albericio, Tetrahedron 2011, 67, 8595–8606 を参照。強制条件下のラセミ化およびアスパルチミドについては S. A. Palasek, Z. J. Cox, J. M. Collins, J. Pept. Sci. 2007, 13, 143–148）。

欧州ガイドラインはこの限界を欠陥として扱うのではなく、自らの期待事項に組み込んでいる。目的ペプチドと、構造的に関連する前後に溶出する不純物との完全な分離は常に達成されるわけではないため、フラクションを採取して純度の高いものを合わせ、純度の低いサイドフラクションは別途の判定基準のもとで再精製してよく、日常的な再精製は再加工ではなく製造の一部とみなされる——したがって工程バリデーションの範囲に入る。

精製は濾過器ではなく、選択性の予算である。収率を回収するために採取範囲を広げれば、構造の近い化学種がより多く入り込む。狭めれば製品を捨てることになる。開示された直線的経路は、70〜90%の粗生成物から97.7%超、収率46%に至るまでに、逐次2回の逆相精製、接線流濾過、共供給による析出、および加湿工程を費やしている。この算術こそ、上流での予防——より良いカップリング、より清浄なビルディングブロック、不合格にできる中間体——が、下流での分離よりも一般に価値が高い理由である。

分析が解決すべきものは分子量だけではない

分析のパッケージは4つの異なる問いに答えるものであり、それらを混同することが試験成績書を読む際に最も多い誤りである。

検出は、ある化学種がそもそも見えるかを問う。ガイドラインは、適切な下限範囲をもつ高度に特異的な方法を求めている。同定はそれが何であるかを問うが、インタクト質量は範囲を狭めるだけで確定はしない。デプシペプチド異性体、LeuにかわるIleの置換、エピマーを区別できない。いずれも製品と分子式を共有するからである。修飾の位置を特定するには断片化の情報が必要である。MS/MSによる配列決定、またはペプチドマッピングである。定量はどれだけあるかを問い、ここで標準品が要となる。標準品がなくてもピークの積分はできるが、濃度と限度値を与えることは通常できない。安全性確認はある水準が安全性の観点で許容できるかを問う。これは毒性学および臨床の問題であり、分析の問題ではない。

この最後の点には注意が必要である。閾値が適用される境界は自動的に決まるものではない。ICH Q3A(R2) はその前文で、ペプチドは同ガイドラインが対象としない原薬の類型に含まれると述べている（ICH, Q3A(R2), Step 4 version, 25 October 2006）。また2025年の欧州ペプチドガイドラインが存在する理由の一部は、合成ペプチドが ICH Q3A/B、Q6A/B、M7 の範囲の全部または一部の外側にあることである。それでも2022年のEPARは、本製品について Q3A の閾値に対する安全性確認が行われたことを記載している。両者はともに成り立つ。低分子の閾値が複雑な合成ペプチドに自動的に適用されるわけではないが、個別の審査において、それらを適用することが妥当だと結論されることもありうる。擁護できないのは、既定としてそれらを持ち込むことである。

立体化学には固有の方法論上の落とし穴があり、ガイドラインの解決法は巧みである。酸加水分解後のキラルGCはD-アミノ酸含量を定量する標準的な手法だが、加水分解そのものがある程度のエピマー化を誘発するため、分析は自らが直前に作り出した欠陥を測ってしまうことになる。ガイドラインが記述している方法は、重水素化塩酸中で加水分解を行うものである。こうすれば加水分解の段階で生じたエピマー化は重水素化アミノ酸を与え、キラルGCとタンデムに配置した質量分析検出器で区別できる。

原材料から、何を示さなければならないかまで

これらの資料を合わせて読むと、管理戦略は出荷時に集中するのではなく、工程全体に分散して配置されるものとして描かれる。保護アミノ酸の規格は、通常の純度試験では見えない属性——鏡像体および立体異性体の含量、β-アラニル体、遊離アミノ酸、酢酸——に及ぶ。Aibおよび脂質側鎖中間体は汎用品ではない投入物であり、その供給者または経路の変更は原薬製造工程の変更である。樹脂担持量——開示された実施例では約0.65〜0.76 mmol/g——は、カタログ番号ではなく、不純物上の帰結を伴う工程パラメータである。Lys20の直交工程は固有の残留物の問題を伴い、一方の経路はパラジウム、他方はヒドラジンを用いる。また工程パラメータには、特定部位での溶媒の種類、フロー反応の滞留時間、樹脂結合中間体の−20 °Cでの保管が含まれる。最終出荷は、EPARによれば、RP-LC-UV、ペプチドマップ、細胞に基づく生物活性試験による確認試験、含量試験、RP-LC-UVおよびRP-LC-MSによる純度、SECによる高分子量体、残留溶媒、水分、エンドトキシン、微生物限度を含む。

以下の問いは「誰が答えられるか」で整理してある。これらをすべて供給者への質問票として扱うと、工程の所有者にしかできない作業を割り当て間違えることになる。

管理上の問い	責任主体	期待されるエビデンス
このビルディングブロックのどの不純物がカップリング中に取り込まれうるか、どのように限度設定しているか、また鏡像体含量、遊離アミノ酸、酢酸はどの方法で測定しているか	ビルディングブロックの供給者	反応性に基づく分類と個別の限度値。総量の一つの数値ではない。また純度試験では見えないものを捉える方法
工程はどこで抵抗を示し、そこでどの条件を用いているか	ペプチド製造者／CDMO	部位ごとの工程知識——どのカップリングを延長しているか、どこでどの溶媒を維持しているか、またその理由
Lys20の脱保護とアシル化の完結はどのように確認しているか、また側鎖がLys16ではなくLys20上にあることをどのように示しているか	ペプチド製造者／CDMO	数値目標を伴う定量的な工程内管理、および修飾の位置を特定できる方法
どの不純物が最終精製に依存し、どれを上流で管理しなければならないか。また第二の経路が並行して稼働する場合、どの同等性データが裏付けとなるか	申請者／工程の所有者	不純物の類型ごとの挙動と除去の評価、原薬の同等性、複雑なペプチドでは製剤の同等性
経路、ビルディングブロックの供給者、保護基戦略の変更はどのように評価するか	品質契約	通知義務、および不純物プロファイルを再確立することの明示的な要求
これらの方法は質量が同一の変異体——エピマー、デプシペプチド、LeuにかわるIleの置換——を区別できるか	申請者と製造者が共同で	標準品に対して実証された分離能。特異性についての主張ではなく

表4. チルゼパチドと同種の製品の製造における管理上の問い。実際に誰が答えられるかで分類した。

結論

チルゼパチド製造の難しさは、鎖長だけ、脂質化だけ、精製だけから来るのではない。それらの間の結合から来る。

鎖が長いということは、事象が多く、そのそれぞれが累積して掛け合わされる小さな失敗確率を伴うということである。立体障害のある非天然残基があるということは、平均的なカップリング条件がどこでも成り立つわけではないということであり、先行開発者自身の文書が、その実施例においてどこで成り立たなかったかを挙げている。修飾されていない第二のリジンがあるということは、選択的アシル化を前提にできず、設計して作り込まなければならないということである。分岐した側鎖があるということは、最も帰結の大きい工程に第二の供給網が流れ込むということである。そして疎水性で分離する精製であるということは、製品に最も似た失敗生成物——エピマー、デプシペプチド異性体、質量が同一の置換体——が最も除去されにくいということである。

その結果として、管理戦略は集中型ではなく分散型でなければならなくなる。ビルディングブロック、ある脱保護、あるカップリングにおけるわずかな逸脱は、通常は明白な失敗として姿を現さない。それは、鎖長が正しく、質量もほぼ同じで、構造は異なり、しかも除去しにくい最終製品の不純物へと転化する。だからこそ、この種の工程について最も情報量の多い問いは、どの純度に到達できるかではなく、もはやどの誤りを犯しえないかである。

よくある質問

チルゼパチドは遺伝子組換えによる発現で製造されるのか、化学合成で製造されるのか

化学合成である。欧州の審査報告書は当該原薬を、固相ペプチド合成により製造しクロマトグラフィーで精製した39アミノ酸の合成ペプチドとして記述している。そのうち2残基と、Lys20側鎖の全体はコードできないため、純粋に遺伝子組換えによる経路では、さらに化学的な工程を加えないとこの分子には到達できない。

39残基のペプチドを一定の品質で合成することがなぜ難しいのか

逐次的な構築が累積するためである。約38回のカップリングと同程度の回数の脱保護が、それぞれ非常に高い効率で成功しなければ、大半の鎖は全長に達しない。しかも失敗生成物は明らかに別の化合物ではなく、配列の変異体である。直線的な経路では、誤った工程をそこで捕捉できる単離中間体も存在しない。

チルゼパチドはなぜ特定のリジンで脂質化されているのか

C20脂肪族ジカルボン酸がアルブミン結合を可能にし、それによって半減期が延長され、週1回投与が成り立つ——創製時の論文と添付文書はいずれもそう述べている。製造の観点からは、要求は選択性である。この分子にはリジンが2つあり、Lys20が規定された部位であって、規定された構造においてLys16は修飾されていない。開示された経路はLys20に直交保護基を用いる。化合物特許ではパラジウム触媒でAllocを脱離させ、製造方法特許ではヒドラジンでivDdeを脱離させる。その間、Lys16は最終切断まで保護されたままである。Lys16がアシル化された化学種が実質的な水準で生じることがあるかどうかは、本稿で確認した資料には報告されていない。

完全に直線的な経路と比べて、SPPS/LPPSハイブリッドは何を改善するのか

開示された経路では、より短いフラグメントを並行して構築し、精製し、組立の前に規格適合を確認できる。そのためフラグメント内部の欠陥は、最後まで運ばれるのではなく不合格にできる。その後、溶液中でのカップリングの合間にナノ濾過または接線流濾過が試薬を除去する。同時に、直線的経路にはないリスクも生じる。主として、活性化された各フラグメントC末端でのエピマー化と、フラグメントのカップリング不完全である。リスクを再配分するが除去はせず、また公開情報は現在どの経路が用いられているかを確定していない。

最終のHPLC精製はチルゼパチド関連不純物をすべて除去できるのか

本稿で確認した資料は、その期待を支持していない。発効済みの欧州ペプチドガイドラインは、目的ペプチドと構造的に関連する前後に溶出する不純物との完全な分離は常に達成されるわけではないと述べ、フラクションの合わせ込みとサイドフラクションの再精製を、想定される工程のなかに組み込んでいる。製品と分子式を共有する化学種が最も分離しにくい。だからこそ、予防と中間体の管理がより大きな割合の負担を担うことになる。

なぜチルゼパチドの製造は難しいのか：配列構築、脂質化、不純物管理